合成生物改造大腸桿菌生產靛藍,生物染料的回歸

                                      靛藍是用于紡織印染的最古老的染料之一。2009年在秘魯的瓦卡普列塔遺址發現的幾塊紡織品殘片,將人類掌握靛藍染色技術的時間追溯到6000年前。在這之前發現的最早的記錄是在距今4400年前埃及法老第五王朝墓中發現的靛藍染色花邊。從2700多年前兩河流域的菘藍種植,到1880年人們發明了人造靛藍,漫長歷史中靛藍作為優秀的著色劑,被用于建筑壁畫、器皿紋樣、紋身以及布料染色等等。到1913年,人造靛藍基本取代了天然的靛藍顏料,人們所穿的牛仔褲就是用人造靛藍染色的。

                                      據說牛仔褲最初是由波西米亞移民利瓦伊 · 斯特勞斯(Levi Strauss)于1850年在加利福尼亞淘金熱中發明,我們也知道牛仔褲顏色各異,從石洗灰白色到近乎黑色,而靛藍可以提供各種不同的效果。在18世紀,英國染工曾將各種靛藍顏色由淺到深正式分類,包括:奶藍、珍珠藍、灰藍、平光藍、中間藍、天藍、女王藍、淺藍(watchet blue)、束帶藍(garter blue)、馬扎里藍(mazareen blue)、深藍和海軍藍。

                                      現代社會,為了滿足人們對藍色牛仔布永不停休的熱情,工廠每年都會生產超過45,000 噸合成靛藍染料。如此之大的產量帶來了不少環保問題。

                                      首先,合成靛藍的原料是石油化工產品苯胺,合成靛藍的過程也涉及多種有毒有害的化學品,如氰化氫、甲醛、強堿等等。

                                      其次,靛藍微溶于水,這使得它在染色過程中必須先被轉化為易溶于水的形式——被稱為隱色靛藍的靛白,靛白吸附至織物中的纖維表面,再重新氧化成為靛藍,織物才被染成藍色。

                                      靛藍染料,來源:botanicalcolors

                                      這個過程會產生大量具有腐蝕性的硫酸鹽和亞硫酸鹽廢物,進而腐蝕染料廠的管道和其他設備,其中大部分廢物被排入河流和溪流,對環境也會造成極大的污染。時尚行業蓬勃發展,人們對服裝染料需求的逐年升高,這使得其造成的生態后果持續惡劣。

                                      時裝行業的染色過程是能源密集和水密集的,有業內人士稱,1 噸染料的生產需要使用近 1000 立方米的水、100 噸重石油化合物、以及 10 噸有毒和腐蝕性的化學品,以及至少 100 兆焦耳的能源。。

                                      紡織污染,來源:sustainbyka

                                      合成生物-大腸桿菌的靛藍

                                      為了生態,是否要犧牲掉我們對牛仔服飾的熱情?科學家總有辦法。他們宣布已經開發出一種環保技術來生產牛仔原色。有研究人員在《自然化學生物學》雜志上評價該技術尚不具備商業可行性,但有望“對歷史悠久但不可持續的靛藍染色工藝進行革新?!?/p>

                                      這種方法是使用實驗室培養的大腸桿菌來制作靛藍,并應用于牛仔褲染色。大腸桿菌是與我們日常生活關系非常密切的一類細菌,一種在顯微鏡下呈膠囊狀的腸道細菌,同時它也是結構最簡單的生物體之一。

                                      大腸桿菌,來源:csmonitor

                                      那么,細菌是如何給牛仔褲上色的呢?靈感來源于自然界。

                                      菘藍(果),來源:Nat. Chem.

                                      首先,一些植物中具有靛藍色素的“前體”,經過一定的化學反應,就可以變成靛藍色素,比如菘藍中含有的吲哚酚(Indoxyl),它不是很穩定,植物自己就在葡萄糖基轉移酶的作用下將其轉化為穩定的吲哚苷(Indican),便于儲存。也許你已經發現了,這些復雜化學名詞的英文與靛藍(Indigo)同源。在人為可控的環境條件下,吲哚苷會轉化回吲哚酚,接著,由于它不穩定,發生氧化,形成靛藍,進而將葉子染藍。

                                      大腸桿菌中產生吲哚苷,并最終形成靛藍的路線,來源:Nat. Chem.

                                      于是,參考這個過程,借助基因工程手段,研究者將菘藍中的葡萄糖基轉移酶基因植入大腸桿菌體內,這樣,大腸桿菌便擁有了合成吲哚苷的能力,然后提取出這些吲哚苷,溶解在水中,用相同的環境條件,使其轉化回吲哚酚,再進行氧化,靛藍便染色成功了。

                                      大腸桿菌的菌落,經過基因改造以產生染料靛藍 ,來源:pixels

                                      這可謂是向大自然學習借鑒的典范。生物工程的染色方式比傳統化學合成方式更為環保,減少了很多化學污染。

                                      首爾國立大學的Byung-Gee Kim團隊為了解決泰爾紫的高成本合成問題,從細胞合成的角度入手,利用大腸桿菌設計了一種雙細胞6BrIG的合成體系,通過對鹵代酶的N端修飾改性,提高了鹵代酶的溶解度,高產率的合成了靛藍染料6BrIG。利用這一方法,團隊合成了一系列的靛藍染料,并將其用于織物的生物染色中,為靛藍染料的低成本高產率合成提供了新的思路。

                                      研究要點1:提出了利用大腸桿菌生物合成高成本貴族紫染料的方法并設計了先溴代后吲哚的合成步驟

                                      為實現生物合成6BrIG,團隊選擇6-溴鹵代酶(SttH,于鏈霉素中發現)、色氨酸酶(TnaA)和單加氧酶(MaFMO)作為合成中的關鍵酶。團隊設計了兩種合成路線:1.色氨酸(Trp)先鹵代后生成吲哚,最后合成6BrIG。2. Trp先生成吲哚后鹵代,最后合成6BrIG。用改造大腸桿菌?tnaA(可以控制TnaA表達)、和SttH對兩種路線進行評估。對于路線1,為了實現Trp的先鹵代,需要使用SttH酶,并提供FADH2?;诖?,團隊將SttH的N端用link連接并進行Fre修飾,Fre為反應提供FADH2。通過HPLC對鹵代產物產率的分析,團隊證實了路線1具有更高的產率。

                                      圖2. A)6BrIG的傳統合成方法、化學合成方法和論文中提出的生物合成步驟2。B)細胞合成方案2的合成路線。Trp經過鹵代酶合成6-Br-Trp隨后通過TnaA酶吲哚化再通過單加氧酶MO合成6BrIG。C)通過HPLC評估分別用吲哚或色氨酸作為起始步驟合成鹵代產物的效率。

                                      研究要點2:利用N-端修飾Fre提高溴化酶SttH溶解性,提高溴化效率。設計了雙細胞合成染料策略,避免副反應對體系合成效率的影響。

                                      由于SttH鹵代酶的低溶解度會導致后續反應的低產率,因此需要增加SttH的溶解性能。團隊首先利用SDS電泳評估了SttH在大腸桿菌中的表達情況,如圖3所示,雖然SttH在細胞中大量表達,然而其可溶性很低。為了解決這一問題,團隊將黃素氧化還原蛋白(Fre)通過link基團修飾到SttH的N端,Fre在大腸桿菌中高度表達且具有良好的溶解性并能為合成提供所需的FADH2。選擇三個link(兩個柔性一個剛性),設計了三種修飾SttH。SDS電泳評估了改進SttH的表達,結果顯示三種修飾方法都提高了SttH的溶解度(L1:1.59 μM,L2:1.62 μM和L3:1.64 μM vs SttH:0.53 μM)但同時也降低了SttH的總表達水平。進一步,團隊將三種修飾SttH在細胞內評估其反應活性(6-Br-Trp的產生量),結果顯示三種SttH與未修飾相比產物的產率都提高了60%以上,而Fre-L3-SttH具有最高的活性。綜合實驗結果,團隊選擇了性能最好的Fre-L3-SttH作為反應的鹵代酶。為了證明6-Br-Trp產率的提高來自于L3還是Fre,團隊選擇了麥芽糖結合蛋白(MBP)作為對照修飾物,設計了不同SttH修飾和對照的實驗組,并對SttH的表達和6-Br-Trp產率進行評估(“-”代表與分子連接,“+”代表直接添加該成分)。如圖3,Fre的游離加入和Fre與SttH的修飾均會提高6-Br-Trp的表達,而將Fre替換為MBP后,SttH的表達和6-Br-Trp產率均下降。

                                      圖3. A)Fre和link修飾SttH的N端的示意圖。Fre能夠為SttH反應提供必要的FADH2。B)SDS電泳展現不同SttH修飾的SttH鹵代酶的表達情況。T表示總表達的量,S表示表達酶溶解后的量??梢钥闯鼋涍^Fre-link-SttH修飾后的蛋白溶解量增加但總量減少。C)不同SttH修飾情況下進行細胞的Trp鹵代,產生6-Br-Trp的量??梢钥闯鋈NSttH與未修飾相比鹵代產率都提高了。D)將Fre替換為MBP后用SDS電泳評估SttH酶的總表達量和酶溶解后的量。與Fre修飾相比MBP的表達量均有所減少。E)不同SttH修飾情況下進行細胞的Trp鹵代,產生6-Br-Trp的量??梢钥闯鯢re和link的修飾都會影響鹵代產率。

                                      隨后團隊按照路線1的合成方案,在?tnaA大腸桿菌中利用Fre-L3-SttH合成。通過誘導TnaA和SttH的表達,在大腸桿菌中實現6-Br-indole的合成,然而反應在進行24 h后僅僅產生了0.03 M的6-Br-Trp和0.38 M的6-Br-indole。折算6-Br-Trp產率僅為22%,與單獨Fre-L3-SttH合成6-Br-Trp的產率差異巨大(95.7%,24h)。為了弄清產率較低的原因,團隊測試了單一?tnaA(不表達TnaA),?tnaA Fre-L3-SttH(表達TnaA和SttH的?tnaA)和?tnaA TnaA(表達TnaA的?tnaA)對Trp的活性,結果如圖4,只要表達了TnA,Trp的反應活性明降低。因此,當Fre-L3-SttH和TnaA在單個細胞中共同表達時,相當一部分Trp被引導產生吲哚,發生了反應2。為了防止反應2的產生,提高6-Br-Trp的產率,團隊提出了雙細胞的合成策略:首先在一批細胞中合成6-Br-Trp,通過優化,24 h后6-Br-Trp達到最后產率,基本反應完全。此時加入另一批?tnaA TnaA細胞使其生成6-Br-indole,12 h后進行最后的反應生成6BrIG。該路線可以利用90%~的6-Br-Trp進行反應達到最好的6BrIG合成效果。

                                      圖4. A)ΔtnaA Free-L3-SttH + TnaA體系,以2.5 mM色氨酸全細胞反應,不同時間下色氨酸(Trp)、吲哚(indole)、6-Br-Trp和6-Br-indoloe的濃度。B)單一?tnaA(不表達TnaA),?tnaA Fre-L3-SttH(表達TnaA和SttH的?tnaA)和?tnaA TnaA(表達TnaA的?tnaA)三個體系,以Trp全細胞反應不同時間下Trp的剩余濃度。C)ΔtnaA Free-L3-SttH體系,以2.5 mM色氨酸全細胞反應,不同時間下Trp和6-Br-Trp的濃度。D)在C)中的ΔtnaA Free-L3-SttH體系反應24 h后加入?tnaA TnaA體系細胞進行反應,同樣以2.5 mM色氨酸全細胞反應,不同時間后Trp、indole、6-Br-Trp和6-Br-indoloe的濃度。E)雙細胞的合成策略原理:防止Trp在不同階段與TnaA反應生成吲哚,提高6-Br-Trp產率。

                                      研究要點3:使用該合成策略實現對布料的細菌染色,并合成了多種顏色的染料衍生物。

                                      團隊最后評估了反應最后一步不同單加氧酶對6BrIG的合成效果,使用了目前報道的兩種成熟的酶:CYP102G4和MaFMO進行最后反應,通過優化條件,團隊擬定在?tnaA Fre-L3-SttH反應24 h后同時加入?tnaA TnaA和單加氧酶。評估最終的產率,MaFMO的合成效果最好并且整個反應在12 h后基本達到平衡。最終,團隊評估了整個路線的合成效率,實現了2.5 mM的Trp合成了0.75 mM的6BrIG。

                                      圖5. A)第二步細胞反應,ΔtnaA TnaA MaFMO體系,以2 mM 6-Br-Trp全細胞反應,不同時間下色氨酸(Trp)、6BrIG和6-Br-indoloe的濃度。B)優化選擇最后單加氧酶的條件,從結果可以看出MaFMO的6BrIG合成效果最好。

                                      與傳統的染色相比,印染纖維需要大量的染料投入,對于6BrIG來說具有高昂的原料成本。這里團隊基于大腸桿菌的細胞染料合成策略,利用細胞染色對不同的纖維織料進行細菌染色。與體外相同量的6BrIG染色對比,細胞染色同樣具有良好的印染能力。團隊通過K/S(吸收系數K,和散射系數S,其比值用于確定染色織物顏色深度)的值來評估染色效率,結果顯示兩種方法幾乎沒有差別。最后,將含有6BrIG的大腸桿菌細胞顆粒用于染色羊毛紗布,作為概念驗證應用,得到了6BrIG的自然顏色樣品。

                                      圖6. A)通過雙細胞體系合成6BrIG染料(左)和吲哚染料(右)通過連續的雙細胞反應體系獲得,左邊體系Fre-L3-SttH表達,右邊SttH不表達。B)使用雙體系6BrIG的大腸桿菌對不同織料染色。從上到下由聚酯、絲綢、腈綸、人造絲、羊毛、醋酸酯、尼龍和棉花組成。對比化學6BrIG 體外染色和大腸桿菌細胞染色的K/S值,二者基本一致。C)用6BrIG細胞染料對樣本(100%羊毛織物)進行染色。D)用6BrIG體外化學染色和細胞染色、吲哚體外化學染色和細胞染色印染羊毛織物的顏色指標。E)對比化學吲哚染料 體外染色和大腸桿菌細胞染色的K/S值,二者基本一致。

                                      同樣,團隊還將設計方案擴展至其他靛藍染料的細胞合成上。設計了不同的鹵代酶系列:Fre-L3–Th-Hal, Fre-L3–PyrH and Fre-L3–RebH。同樣用SDS凝膠電泳和鹵代產物含量比較評估了相應鹵代酶的溶解度水平和鹵代酶的活性,結果顯示Fre-L3–修飾的酶具有更好的溶劑性和鹵代效果。團隊利用這些酶在細胞中同樣合成了具有不同鹵代的靛藍染料衍生物,包含多個顏色。

                                      圖7. A)DS電泳展現Fre-L3修飾不同結構鹵代酶的表達情況。T表示總表達的量,S表示表達酶溶解后的量??梢钥闯鼋涍^Fre-link3修飾后的蛋白溶解量增加但總量減少。B)Fre-L3修飾不同結構鹵代酶情況下進行不同靛藍衍生物分子鹵代,產生鹵代中間產物的量??梢钥闯雠c未修飾相比鹵代產率都提高了。C)利用提出的雙細胞體系修飾不同的鹵代酶,合成不同的靛藍染料。根據鹵代位置和基團的不同具有廣泛的顏色。

                                      一级黄色毛片子